大庆师范学院 本科生毕业论文
蛋白酶产生菌培养条件的条件优化
院(部)、专业 生命科学学院 生物技术 研 究 方 向 微生物学 学 生 姓 名 朱琳 学 号 200901122598 指导教师姓名 张亦婷
2013年 06月 01日
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摘 要
采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化
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Abstract
The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.
Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization
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目 录
摘 要 ............................................................................................................................................................. 1 Abstract ............................................................................................................................................................ 2 1 引言 ........................................................................................................................................................... 2 材料与方法 ................................................................................................................................................. 3
2.2.2 实验材料.............................................................................................................................. 3 2.2.1 菌株筛选 ............................................................................................................................ 3
3.1 菌株筛选 ............................................................................................................................................... 6
3.1.1 菌株的分离筛选 ................................................................................................................ 6 2.3 条件优化.................................................................................................................................. 7 2.3.1 不同碳源对产酶的影响 ...................................................................................................... 7 2.3.3不同氮源对产酶的影响 ....................................................................................................... 8 2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 ................................................................................ 9 2.3.5 不同温度对产酶的影响 .................................................................................................... 10
4 结 论 ....................................................................................................................................................... 10
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1 引 言
蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、
医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。
本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。
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2 材料及方法
2.1 实验材料与仪器
2.1.1 实验仪器
高压灭菌锅 恒温振荡培养箱 超净工作台 电子分析天平 pH测量仪 水浴锅 微波炉 细胞破碎仪 2.2.2 实验材料
①样品：取自大庆师范学院附近的土壤。
②主要试剂：脱脂奶粉，氯化钠（NaCl），蔗糖，尿素，琼脂粉，牛肉膏，乳糖，淀粉，葡萄糖，铵(NH4NO3) ，蛋白胨，结晶紫，干酪素，琼脂，氢氧化钠，1%酚酞指示剂，甲醛 ③ 培养基
种子斜面培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂粉20.0g，水1000ml，121℃灭菌20min，备用。
筛选培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉20.0g，脱脂奶粉25.0g，水1000ml，106℃灭菌6min，备用。
酪素培养基(基础培养基)：牛肉膏0.3g，酪素1.0g，NaCl0.5g，水100ml，PH7.6~8.0，121℃灭菌20min，备用。
牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.09g，蛋白胨0.3g，NaCl0.15g，水30ml，PH7.4~7.6，备用。④试剂配制
1N NaOH溶液：NaOH 1g，溶于250ml水中。 1%酚酞指示剂：5g酚酞溶于95ml95%乙醇中。
2.2 实验方法
2.2.1 菌株筛选
富集：将从大庆师范学院附近，实验楼前植物园土壤及养殖场附近的土壤采集的土壤 ,分别称取5g土样，放入装有45ml无菌水的三角瓶中，37℃震荡培养24h。
初筛：将富集培养的菌液取1ml，用无菌水依次稀释到10-7，分别取 10-5 、10-6 、
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10-7 三个梯度各0.1ml土壤稀释液制成混菌平板，将培养皿放入37℃培养箱中培养24h[8,9]。取出培养好的平皿，选择生长良好、形态明显的单菌落，用接种环挑种到牛奶筛选培养基上，每个平皿中接4-5个，37℃培养箱中培养24h。挑选出能在牛奶筛选培养基上产生水解圈的单菌落，接种到斜面培养基上，放入冰箱冷藏。
复筛:从冰箱中取出初筛得到的菌株，转接试管斜面活化，37℃下恒温培养 24 h。各取1环，接种到装液量为20ml基础培养基的50ml三角瓶中，在37℃条件下摇床培养24h。分别取各菌株发酵液10μl滴加在牛奶筛选平板中的滤纸片上 (直径为12mm)，然后将培养皿放入37℃的培养箱中培养24h，取出后测量水解圈直径与菌落直径。重复此过程3次，取平均值，选取水解圈直径与菌落直径差值最大的菌株作为出发菌株whr1。 2.2.2 蛋白酶产生菌酶活力的测定
测定酶活方法：根据蛋白酶产氮量测定酶活力大小。将菌液用细胞破碎仪破碎10min，充分摇匀后用脱脂棉过滤，吸取绿叶10ml移至150ml锥形瓶中，加水50ml，1%酚酞指示剂0.2ml，以0.1NaOH标准溶液滴定至刚显红色（ PH 8.2 ），记下滴定数作为点酸，继续加甲醛10ml，用NaOH滴定至深红色（ PH8.5 ）为终点。加下滴定数。
2.2.3 产酶条件优化
不同碳源对产酶的影响：在100ml基础培养基中其他成分不变，选用4种浓度分别为5g/L，10g/L, 15g/L, 20g/L, 30g/L的不同的碳源，分别为牛肉膏、乳糖、淀粉、葡萄糖，37℃ 140 rpm培养24h，测其酶活。
不同氮源对产酶的影响：在100ml基础培养基中加入最优碳源，氮源改用5种浓度
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分别为5g/L，10g/L, 15g/L, 20g/L, 30g/L的不同的氮源，其他成分不变，分别是尿素、(NH4)2NO4、牛奶，37℃培养24h，测其酶活。
不同培养基初始pH值对产酶的影响：在100ml基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变，选用5种不同的pH，分别是pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 9，37℃培养24h，测其酶活。
不同温度对产酶的影响：在100ml基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变，采用最优pH值，分别在25℃、30℃、35℃、37℃、39℃下以最优时间培养，测其酶活[6,9]。
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3 实验结果
3.1 菌株筛选
3.1.1 菌株的分离筛选
将土样利用牛奶筛选培养基分离得到具有蛋白酶活性的菌株，选出其中水解圈较大的whr1号菌株进行后续实验，并斜面保藏。
图2-1 菌种筛选 图2-2 菌种筛选
图2-3 菌种筛选
3.1.2 菌株的形态特征
对whr1号菌株分离纯化，在37℃培养24h后，观察单菌落，菌落呈透明乳黄色，湿润，菌落表面光滑，边缘形状不规则[7]。革兰氏染色后，显微镜观察菌体呈蓝紫色，是阳性，菌体成直杆状。
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图2-4 whr1革兰氏染色
2.3 条件优化
2.3.1 不同碳源对产酶的影响
不同碳源对产酶的影响：在100ml基础培养基中其他成分不变，选用4种浓度为5g/L，10g/L, 15g/L, 20g/L, 30g/L的不同的碳源，分别为牛肉膏、乳糖、淀粉、葡萄糖，37℃培养24h，测其酶活。实验结果如图2-7所示：
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图2-7 不同浓度碳源对酶活性的影响
从表中可以看出，15g/L牛肉膏最有利于产酶，酶活最大，与各个碳源之间差异极显著；淀粉次之，然后为葡萄糖，乳糖最小，故选择牛肉膏为whr1菌株发酵培养基的碳源。
2.3.3不同氮源对产酶的影响
不同氮源对产酶的影响：在100ml发酵培养基中加入最优碳源，氮源改用5种浓度分别为5g/l, 10g/L, 15g/L, 20g/L, 30g/L的不同的氮源，其他成分不变，分别是尿素、NH4NO4、牛奶，37℃培养24h，测其酶活。实验结果如图2-8所示
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图2-8 氮源对酶活性的影响
由表可知铵最有利于产酶，酶活性最大。其次为牛奶，最后为尿素。由此结果，
选择铵为whr1菌株发酵培养基的氮源。
2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响
培养基不同初始pH值对产酶的影响：在100ml基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变,选用5种不同的pH，分别是pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 9，37℃以最优时间培养，测其酶活，实验结果如图2-9所示。
图2-9 pH值对酶活性的影响
对大多数菌种来说，菌种有保持其体内细胞酸质度在近中性条件的能力，这样有利于菌体进行正常的新陈代谢和各种酶反应。但介质的pH值对细胞的新陈代谢和产酶有间接的影响。我们只做了培养基起始pH对产酶的影响，分别调整发酵液起始pH为6.0，
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6.5，7.0，7.5，8.0，9.0，其它条件固定，测定蛋白酶活力。结果表明，发酵培养基的起始pH值为6.0时，酶活力最高，与各个pH值差异极显著。pH偏高或偏低，都不利于菌体产酶。因此，确定发酵培养基的起始pH值为6.0。 2.3.5 不同温度对产酶的影响
不同温度对产酶的影响：在50ml基础培养基中加入最优碳、氮源,其他成分不变，采用最优pH值，分别在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃下140rpm以最优时间培养，测其酶活。实验结果如图2-10所示
图2-10 温度对酶活性的影响
由于大多数细菌为中温菌，因此本试验选择了分别设定发酵温度为31℃，33℃，35℃，37℃，39℃，其它条件固定，测定蛋白酶活力。35℃产酶量最高，与其他温度差异极显著。为其最适培养温度。温度的变化不但会影响发酵液的物理性质，也会影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质。温度升高，反应速率加大，生长代谢快，生产期提前，但是菌体容易衰老，发酵周期缩短，从而影响酶的最终产量。此外，温度高。最初细菌大量繁殖，其进行分解代谢释放的热量．使整个发酵体系的温度变得更高，加速了细菌的死亡。因此，要得到高产量的产物，必须选择适宜的发酵温度。若温度过低，细菌增殖周期加长，细菌总量较低，直接影响酶产量。
4 结 论
（1）通过牛奶筛选培养基采用透明圈法从采集的土样中筛选得到蛋白酶产生菌
whr1，对其纯化分离，培养一天后，进行形态学鉴定。在普通营养琼脂平板上菌落生长为边缘整齐，菌落成乳白色，菌落表面不透明，不产生色素。初步鉴定为芽孢杆菌。 （2）whr1号菌株的种子液扩大培养，发酵液在37℃ 140rpm条件下，培养到24h 酶活达到最大值。
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（3）实验得出培养基最佳条件为：培养基中最佳碳源添加量为质量浓度15g/L的牛肉膏，最佳氮源添加量为质量浓度1.30g/l的铵，最适初始pH值为6. 0，最适发酵温度为35℃。
通过对筛选出的蛋白酶产生菌的相关特性研究，我们可以通过改变或者调节菌株的外界条件来提高酶活性，使其可以应用与工业生产中，发挥生物资源的优势。
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参考文献：
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